新生儿筛查所用血苯丙氨酸测定的有两种方法：Gushrie细菌抑制法：正常深度小于120微摩尔/升（2毫克/分升），PKU大于120微摩尔/升。

　　苯丙氨酸荧光定量法：正常值同细菌抑制法。

　　苯丙氨酸负荷试验：对血苯丙氨酸浓度大于正常浓度，小于1200微摩尔/升者口服苯丙氨100毫克/千克，服前、服后1、2、3、4小时分别测定血苯丙氨酸浓度。血苯丙氨酸大于1200微摩尔/升诊断为PKU，小于1200微摩尔/升，为高苯丙氨酸酸血症。

　　血浆游离氨基酸分析和尿液有机酸分析：血浆和尿液的氨基酸、有机酸分析不仅为本病提供诊断依据，同时也可鉴别其他可能的氨基酸、有机酸代谢缺陷。

　　尿蝶呤图谱分析进行四氢一物蝶呤缺乏症的诊断和鉴别诊断。

　　口服四氢生物蝶呤负荷试验，经典型PKU患者因苯丙氨酸羟化酶缺乏，血苯丙氨酸浓度无明显变化。

　　DNA分析：目前对于苯丙酮尿症缺陷可用DNA分析方法进行基因诊断。

　　脑电图：约80%病儿有脑电图异常，可表现为高峰节律紊乱、灶性棘波等。

　　智力测定：评估智能发育程度。